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核酸提取出来了!但这个DNA(RNA)是你想象中的DNA(RNA)么?

2022-12-19 417


核酸提取

知多少


纯化核酸始末


万事开头难,纯化核酸作为绝大部分

分子实验的起始,对后续实验的

成败有着至关重要的影响。

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微量/超微量紫外分光光度计由于可以简单快速、经济实惠地检测核酸浓度及蛋白质、盐离子残留,得到广大科研人员的青睐。



众所周知,A260表示核酸吸光度OD值、A280表示蛋白质浓度吸光度OD值、A230表示盐离子浓度吸光度OD值,因此A260可以换算核酸浓度,A260/280表示蛋白质残留,A260/230表示盐离子残留,但这仅仅是研究人员根据大量测量结果后发现的规律,“约定俗成”地认为在一定程度上可说明DNA、RNA的纯度。并不是核酸产量、纯度鉴定的唯一标准,仅仅作为参考,也不是“金标准”。


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Thermo Fisher ND-2000说明书中重点强调了检测结果的可信度


究其原因,使用微量/超微量紫外分光光度计获得的结果仅仅是从侧面反应核酸产量及纯度,影响因素较多(光路、样本量、样本浓度、pH值、其他影响吸光度测量的离子等),测得的OD值并不一定准确。同时,由于吸光度值测定物质缺少特异性,单链DNA、双链DNA、RNA、dNTPs、以及部分蛋白均在260nm波长处存在吸收峰,单靠A260确定的浓度并不一定是真实DNA或RNA的浓度,且并不能判断其完整性与降解情况。


那么如何判断猪猪视频app官网纯化核酸的质量呢?除使用微量/超微量紫外分光光度计进行检测外,还需要通过琼脂糖凝胶电泳等方法,来直观的显示核酸的纯度及完整度,并在一定程度上标示浓度。这样从多种方法的检测结果中获得的核酸产量、纯度才是可信的。




FG实验图对比


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(OD测量值及相应电泳图)


FG评测指标



是否有核酸产量、质量检测的“金标准”呢?

据猪猪视频app官网所知,简单、快速且廉价的方法暂时是没有的。不论是分光光度计、凝胶电泳,以及质谱检测,均是从不同侧面反应了溶液中核酸浓度及纯度,需要互为参考得出判断。


而最佳的评测指标永远是后续的实验应用,不影响反转录效率、PCR扩增效率,获得可信的扩增产物、Ct值,测序获得完整序列,就是成功的核酸提取。

综上所述,唯比值论的观点,理应受到“以好的下游实验结果,作为好的提取参数”观点的挑战!


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